1980 के दशक के उत्तरार्ध में, हालाँकि, उन्नत लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोपी में एक बड़ा दोष था: कन्फोकल एपर्चर न केवल फोकल बिंदु के बाहर उत्पन्न प्रतिदीप्ति को अवरुद्ध करता है, बल्कि जैविक ऊतकों द्वारा बिखरे हुए फोकल बिंदु द्वारा उत्पन्न प्रतिदीप्ति को भी अवरुद्ध करता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति की संग्रह दक्षता में कमी आती है, और इमेजिंग गहराई 100 माइक्रोमीटर से अधिक नहीं हो सकती है। इसलिए, 1990 के दशक में, लेजर कन्फोकल माइक्रोस्कोपी और दो-फोटॉन उत्तेजना तकनीक को मिलाकर दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी अस्तित्व में आई। दो-फोटॉन अवशोषण प्रक्रिया की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य आम तौर पर 680-1080 एनएम की बायो-ऑप्टिकल विंडो रेंज में सेट की जाती है, जो कोशिकाओं या जीवित जीवों को पराबैंगनी प्रकाश की क्षति से बचाती है और गहराई में प्रवेश करती है।
वर्तमान में, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप फेमटोसेकंड टाइटेनियम रत्न लेजर है, जो भारी और महंगा है, जो जीवन विज्ञान, रसायन विज्ञान और चिकित्सा जैसे विभिन्न क्षेत्रों में दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के अनुप्रयोग को सीमित करता है। इसलिए मेडिकल डायग्नोस्टिक्स जैसे कुछ क्षेत्रों में, लोगों ने मानक प्रकाश स्रोत के रूप में कॉम्पैक्ट और किफायती सब-नैनोसेकंड सॉलिड-स्टेट लेजर का उपयोग करने की कोशिश की है।
दो-फोटॉन उत्तेजना का मूल सिद्धांत यह है कि, जब एक फ्लोरोसेंट अणु उच्च फोटॉन घनत्व के तहत उत्तेजित होता है, तो यह एक साथ दो लंबी-तरंग दैर्ध्य फोटॉन को अवशोषित करता है, और फिर उत्तेजना छलांग और विश्राम प्रक्रियाओं के बाद स्वचालित रूप से फ्लोरोसेंट फोटॉन को वापस जमीनी अवस्था में विकिरणित करता है। पारंपरिक एकल-फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की तुलना में, दो-फोटॉन उत्तेजना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में ऑप्टिकल सिग्नल पीढ़ी गैर-रैखिक होती है, जिसमें उत्तेजना प्रकाश एक लंबी-तरंगदैर्ध्य, उच्च-शिखर-शक्ति प्रकाश स्रोत होता है, और उत्सर्जित फ्लोरोसेंट फोटॉन की तरंग दैर्ध्य होती है उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के आधे से थोड़ा अधिक लंबा।
दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक निकट-अवरक्त लेजर प्रकाश स्रोत का उपयोग करती है, और इसकी गैर-रेखीय प्रकृति के लिए कन्फोकल एपर्चर की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए, कन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में, दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के निम्नलिखित फायदे हैं:
- बड़ी इमेजिंग गहराई और कम ऑप्टिकल क्षति;
- किसी कन्फोकल एपर्चर की आवश्यकता नहीं है, और प्रतिदीप्ति संग्रह दक्षता में काफी सुधार हुआ है;
- उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और कंट्रास्ट;
- छोटी उत्तेजना सीमा, छोटी फोटोटॉक्सिसिटी और ब्लीचिंग;
- उत्सर्जन और उत्तेजना तरंग दैर्ध्य बहुत दूर हैं, वर्णक्रमीय ओवरलैप से बचते हैं;
